- Source: Alfa-komplementasi
α-komplementasi merupakan fenomena di mana subunit α dari enzim β-galaktosidase yang berasal dari vektor plasmid dapat mengaktifkan enzim β-galaktosidase yang gennya(lacZ) telah menjadi mutan pada DNA kromosom bakteri sehingga enzim tersebut dapat menjadi enzim yang fungsional.
Struktur Enzim β-Galaktosidase
Enzim β-galaktosidase terdiri atas 146 asam amino yang terbagi dalam 4 subunit. Bagian yang dekat dengan ujung 5’ pada gen lacZ mengkodekan subunit α yang berfungsi dalam proses tetramerisasi yaitu proses pembentukan struktur 3 dimensi protein tersebut, sementara itu bagian yang dekat dengan ujung 3’ pada lacZ mengkodekan sisi aktif enzim tersebut. Keempat subunit β-galaktosidase harus berkumpul untuk membentuk satu enzim yang fungsional).
Bagian yang terlibat dalam alfa-komplementasi
= lacZ'
=Gen lacZ' merupakan gen yang hanya mengandung subunit α pada β-galaktosidase tetapi tidak mengandung gen yang menyandikan sisi aktif enzim tersebut.} Hal tersebut diakibatkan karena gen lacZ yaitu gen yang menyandikan β-galaktosidase merupakan gen yang cukup besar jika ditaruh seluruhnya di dalam vektor plasmid, oleh sebab itu, dalam vektor plasmid hanya terkandung sebagian dari gen yang menyandikan β-galaktosidase untuk menjaga ukuran plasmid agar tetap kecil.
= lacZ∆M15
=Gen lacZ∆M15 adalah gen penyandi β-galaktosidase yang terdapat pada DNA kromosom bakteri yang telah mengalami delesi sebanyak 90 pasang basa pada sekuens yang dekat dengan ujung 5’. Hal tersebut mengakibatkan subunit α pada enzim β-galaktosidase kehilangan 30 asam amino sehingga tidak dapat melakukan tetramerisasi yaitu yang berhubungan dengan pelipatan protein sehingga enzim ini menjadi tidak fungsional.
Mekanisme
Gen lacZ dalam proses kloning DNA berfungsi sebagai gen pelapor, yaitu gen yang ekspresinya bergantung pada masuk atau tidaknya insert pada vektor kloning. Hal ini disebabkan karena adanya MCR (Multiple Cloning Site) di antara gen penyandi β-galaktosidase.
= Tidak terdapat insert pada vektor kloning
=lacZ akan ditranskripsi secara normal dan dapat membentuk α-complementaion menjadi β-galaktosidase yang dapat memecah X-gal menjadi galaktosa dan turunan indoksil. Turunan tersebut selanjutnya akan dioksidasi sehingga membentuk turunan dibromo-dikloro yang menyebabkan berubahnya warna koloni menjadi biru saat ditumbuhkan pada media agar yang mengandung X-gal.
= Terdapat insert pada vektor kloning
=Akan terdapat tambahan gen insert yang ikut ditranskripsi oleh RNA polimerase. Hal tersebut menyebabkan gen lacZ tersebut tidak dapat membentuk enzim β-galaktosidase yang fungsional dan X-gal tidak akan dipecah sehingga koloni yang dihasilkan tetap berwarna putih.
