Angka paling mungkin (bahasa Inggris: most probable number, disingkat MPN) adalah metode yang digunakan untuk menghitung perkiraan jumlah bakteri dalam suatu bahan atau makanan. Metode ini menggunakan media kultur cair dalam tabung reaksi dan menghitung jumlah tabung positif, yaitu jumlah tabung yang ditumbuhi oleh bakteri setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas yang dihasilkan pada tabung Durham yang diletakkan pada posisi terbalik oleh bakteri pembentuk gas. Metode MPN banyak digunakan dalam penghitungan sel, terutama penghitungan koliform sebagai uji kualitas mikrobiologi air, berdasarkan perkiraan terdekat yaitu perhitungan dalam rentang tertentu, dengan mengacu pada tabel MPN.

Prinsip kerja

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu untuk mendapatkan konsentrasi bakteri yang dibutuhkan. Memasukkan sampel ke dalam tabung akan memastikan laju pertumbuhan tabung positif. Semakin sedikit jumlah sampel yang ditambahkan (semakin besar pengencerannya), maka akan semakin rendah frekuensi tabung reaksi positif. Sebaliknya, semakin banyak jumlah sampel yang ditambahkan (semakin sedikit pengencerannya), maka akan semakin tinggi frekuensi tabung reaksi positif yang muncul. Setiap tabung positif yang diperoleh sangat tergantung pada kemungkinan sel yang ditangkap oleh pipet ketika ditempatkan dalam media kultur. Apabila sampel diencerkan terus-menerus, maka didapatkan larutan tanpa mikroorganisme (steril). Metode MPN biasanya menggunakan rangkaian 3 atau 5 tabung untuk setiap pengenceran. Semakin banyak tabung yang digunakan, maka semakin tinggi akurasinya. Teknik pengenceran ini memberikan hasil yang baik apabila asumsinya terpenuhi, yaitu: Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel homogenat, yang tidak terdapat gaya tarik atau tolak-menolak antarbakteri. Sel bakteri dipisahkan secara individu, tidak dalam bentuk rantai atau kelompok (contoh: koliform termasuk E. coli). Media yang dipilih cocok untuk pertumbuhan bakteri target pada suhu dan waktu inkubasi tertentu, sehingga setidaknya satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif dalam media ini selama masa inkubasi. Jumlah yang diperoleh hanya mewakili bakteri yang hidup. Sel-sel yang terluka yang tidak dapat menghasilkan tabung positif tidak dikenali. Setiap tabung individu memiliki data independen. Tidak ada kontaminasi bahan dan peralatan.

Media

Uji MPN biasanya menggunakan media kaldu laktosa dalam tahap uji pendugaan, dan media kaldu laktosa empedu hijau cerlang (BGLBB) dalam tahap uji penegasan.

= Kaldu laktosa

= Kaldu laktosa (lactosa broth, disingkat LB) digunakan sebagai media untuk mendeteksi koliform dalam air, makanan, dan produk susu. Kaldu laktosa ini dibuat dari bahan ekstrak daging sapi 0,3%; pepton 0,5%; dan laktosa 0,5%. Pepton dan ekstrak daging sapi dapat memberikan nutrisi penting untuk metabolisme bakteri, sedangkan laktosa merupakan sumber karbohidrat bio-fermentasi koliform. Media ini sering digunakan untuk uji pendugaan pada uji koliform yang keberadaannya ditandai adanya gas dalam tabung Durham. Kaldu laktosa digunakan karena koliform memiliki enzim galaktosidase, yang dapat memfermentasi laktosa dengan menghidrolisis laktosa menjadi asam dan gas. Laktosa yang terkandung dalam kaldu laktosa difermentasi menjadi alkohol dan membentuk asam karboksilat. Karena indikator metilena biru, pH media membuat media menjadi kuning dan keruh. Proses fermentasi juga akan membentuk gelembung-gelembung yang menandakan dimulainya proses fermentasi. MPN didasarkan pada aktivitas metabolisme bakteri tersebut, yaitu perubahan warna media dan pembentukan gas dalam tabung Durham terbalik.

= BGLBB

= Kaldu laktosa empedu hijau cerlang (brilliant green lactosa bile broth, BGLBB) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif dan membuat hasil perhitungan bakteri lebih spesifik. Bahan utamanya adalah laktosa (agen fermentasi), garam empedu (agen selektif) dan zat warna hijau cerlang (agen selektif komplit). Komposisi laktosa dan garam empedu ini dapat merangsang pertumbuhan koliform secara optimal. Media BGLBB digunakan untuk mendeteksi bakteri koliform dalam air, makanan, dan produk lainnya. Media ini dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif dan meningkatkan pertumbuhan bakteri koliform (yang tergolong Gram-negatif). Ada atau tidaknya bakteri ditunjukkan dengan terbentuknya asam dan gas yang disebabkan oleh fermentasi laktosa oleh bakteri yang tergolong koliform. Kaldu laktosa hijau cerlang (brilliant green lactose broth, BGLB) dirancang khusus untuk pengujian MPN koliform, yang digunakan untuk menentukan perkiraan paling akurat jumlah koliform yang terdapat dalam sampel 100 ml. Media BGLBB digunakan pada tahap uji penegasan. Media ini berfungsi sebagai penyubur bakteri koliform, dan media selektif untuk bakteri selain koliform.

Tahapan kerja

Beberapa pengujian dalam prosedur ini terdiri dari 3 tahap, yaitu:

= Uji pendugaan

= Uji pendugaan merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui ada tidaknya bakteri koliform berdasarkan pembentukan asam dan gas yang disebabkan oleh fermentasi laktosa oleh bakteri golongan koliform. Pembentukan gas tersebut dapat dilihat pada tabung Durham berupa gelembung-gelembung udara akibat kekeruhan pada medium laktosa. Tabung dianggap positif jika 10% atau lebih gas terbentuk dari volume dalam tabung Durham. Tingkat bakteri koliform dapat ditentukan dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terhadap pembentukan asam dan gas dan membandingkannya dengan tabel MPN. Metode MPN digunakan untuk menghitung jumlah bakteri dalam sampel cair saat inkubasi 1 x 24 jam pada suhu 35 °C. Jika tidak terbentuk gas dalam tabung Durham dalam waktu 2 x 24 jam, maka ini dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung positif dihitung dalam setiap seri. MPN Penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN.

= Uji penegasan

= Uji penegasan dilakukan untuk memastikan bahwa gas yang dihasilkan disebabkan oleh bakteri koliform. Tabung positif yang dihasilkan dari uji pendugaan kemudian dilanjutkan dengan uji penegasan. Sampel positif yang memunculkan gas diinokulasi ke dalam media BGLBB kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 48 jam. Jika gas dihasilkan, dapat diindikasikan bahwa uji penegasan ini positif. Hasil pengujian MPN koliform yang menunjukkan jumlah tabung gas positif kemudian dicatat dan disesuaikan dengan tabel MPN. Angka yang diperoleh pada tabel MPN menunjukkan jumlah koliform pada setiap gram atau ml sampel uji.

= Uji pelengkap

= Uji ini dilakukan hanya jika diperlukan, dengan media yang memberikan hasil positif dalam uji penegasan. Uji koliform tidak selalu harus dilakukan secara lengkap tergantung dari berbagai faktor seperti waktu, kualitas sampel yang diuji, biaya, dan faktor lainnya. Uji pelengkap dilakukan dengan menginokulasi koloni bakteri pada media agar, digoreskan dan diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam. Agar yang digunakan adalah agar eosin metilena biru (EMB). Pertumbuhan koliform diindikasi oleh koliform pada medium agar-agar yang membuat medium menjadi berwarna merah terang.

Hasil

Hasil dari metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN merupakan perkiraan jumlah unit pertumbuhan atau unit pembentuk koloni dalam suatu sampel. Namun secara umum, nilai MPN juga didefinisikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan umumnya adalah per ml atau per gram. Nilai MPN dalam suatu sampel air misalnya 10/gram, yang berarti sampel diperkirakan mengandung 10 koliform pada setiap gramnya. Semakin rendah MPN, semakin tinggi kualitas air dan semakin layak untuk diminum. Metode MPN memiliki reliabilitas 95%, sehingga untuk setiap nilai MPN terdapat range dari nilai MPN yang lebih rendah hingga nilai MPN yang lebih tinggi.

Kelebihan dan kekurangan

Beberapa kelebihan dari metode MPN yaitu dapat meningkatkan akurasi dengan meningkatkan jumlah tabung yang digunakan tiap pengenceran; ukuran sampel (volume) sangat besar dibandingkan dengan metode Angka lempeng total (ALT); sensitivitas pada konsentrasi bakteri rendah, umumnya lebih baik daripada ALT; dan pemulihan yang terbaik karena menggunakan media cair, tetapi tetap tergantung pada partikel dalam sampel yang dapat menyebabkan gangguan. Jika media spesifik yang cocok untuk pertumbuhan bakteri target telah tersedia, maka perhitungan MPN dapat diperkirakan berdasarkan media tersebut. Sementara itu, kekurangan dari metode MPN adalah sampel air yang digunakan hanya sedikit untuk setiap pengujian; dibutuhkan beberapa hari untuk mendapatkan kultur yang baik; jumlah Angka koliform yang dihitung hanya perkiraan; membutuhkan banyak media dan peralatan; tidak dapat dilakukan di lapangan tempat sampel diambil, sehingga memerlukan sistem transportasi khusus untuk meminimalkan perubahan koliform dalam sampel; dan tidak dapat digunakan untuk mengamati morfologi mikroorganisme.

Referensi