Kromatografi fasa terbalik (bahasa Inggris: reversed-phase chromatography, RPC) atau
Kromatografi hidrofobik adalah metode
Kromatografi yang menggunakan
fasa diam hidrofobik. RPC merujuk pada
Kromatografi cair, bukan
Kromatografi gas.
Istilah "
fasa terbalik" mempunyai latar belakang sejarah. Pada tahun 1970an, sebagian besar
Kromatografi cair dilakukan menggunakan pendukung
fasa diam (disebut juga dengan "kolom") berisi resin silika atau alumina yang tidak dimodifikasi. Metode ini disebut "
Kromatografi fasa normal". Pada
Kromatografi fasa normal,
fasa diam adalah hidrofilik sehingga mempunyai afinitas yang kuat terhadap molekul hidrofilik dalam
fasa gerak. Oleh karena itu, molekul-molekul hidrofilik dalam
fasa gerak cenderung untuk terikat (atau teradsorpsi) pada kolom, sementara molekul-molekul hidrofobik mengalir melalui kolom dan dielusi pertama kali. Dalam
Kromatografi fasa normal, molekul hidrofilik dapat dielusi dari kolom dengan menaikkan polaritas larutan dalam
fasa gerak.
Teknik ini diperkenalkan menggunakan rantai alkil yang berikatan kovalen pada
fasa pendukung, menciptakan
fasa diam hidrofobik yang mempunyai afinitas yang lebih kuat terhadap senyawa-senyawa hidrofobik. Penggunaan
fasa diam hidrofobik diperhitungkan sebagai lawan atau "kebalikan" dari
Kromatografi fasa normal, sehingga muncullah istilah "
Kromatografi fasa terbalik".
Kromatografi fasa terbalik melibatkan
fasa gerak polar (aqueous). Akibatnya, molekul-molekul hidrofobik cenderung teradsorpsi pada
fasa diam hidrofobik, dan molekul-molekul hidrofilik dalam
fasa gerak akan melewati kolom dan terelusi lebih dulu. Molekul-molekul hidrofobik dapat dielusi dari kolom dengan menurunkan polaritas
fasa gerak menggunakan pelarut organik (non-polar), yang dapat mengurangi interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu molekul, semakin kuat terikat pada
fasa diam, dan semakin tinggi konsentrasi pelarut organik yang diperlukan untuk mengelusi molekul tersebut.
Banyak perhitungan matematis dan eksperimental yang digunakan dalam metode
Kromatografi lainnya juga diterapkan pada RPC (misal, resolusi pemisahan bergantung pada panjang kolom). Hal ini dapat digunakan untuk pemisahan molekul-molekul dengan variasi luas. Tetapi RPC tidak dapat digunakan untuk pemisahan protein, karena pelarut organik yang digunakan dalam RPC dapat mendenaturasi sebagian besar protein. Berdasarkan alasan inilah,
Kromatografi fasa normal lebih umum digunakan untuk pemisahan protein.
Saat ini, RPC merupakan teknik analisis yang sering digunakan. Tersedia berbagai macam
fasa diam yang digunakan dalam RPC, memungkinkan fleksibilitas dalam pengembangan metode pemisahan.
= fasa diam berbasis silika
=
Segala bahan non-polar inert yang dapat memenuhi syarat pengemasan dapat digunakan dalam
Kromatografi fasa terbalik. Kolom paling populer adalah rantai karbon oktadesil (C18) yang terikat pada silika (klasifikasi USP: L1). Tersedia 297 jenis kolom ini secara komersial. Urutan berikutnya adalah kolom Si-C8 (L7 - 166 kolom), silika murni (L3 - 88 kolom), Si-siano (L10 - 73 kolom), dan Si-fenil (L11 - 72 kolom). Perlu dicatat bahwa C18, C8 dan fenil adalah resin yang didedikasikan khusus untuk
fasa terbalik, sementara kolom siano dapat digunakan dalam mode
fasa terbalik tergantung pada kondisi
fasa gerak dan analitnya. Perlu dicatat bahwa tidak semua kolom C18 mempunyai sifat retensi yang identik. Gugus fungsi pada permukaan silika dapat bekerja dalam reaksi monomerik maupun polimerik dengan organosilan rantai pendek yang digunakan dalam tahapan menutup gugus silanol (end-capping). Meskipun secara keseluruhan mekanisme retensinya tetap sama, sedikit perbedaan kimia permukaan untuk
fasa diam yang berbeda akan membuat perubahan dalam selektivitasnya.
Kolom-kolom modern mempunyai polaritas yang berbeda-beda. PFP adalah pentafluorfenil. CN adalah siano. NH2 adalah amino. ODS adalah oktadesil atau C18. ODCN adalah kolom campuran yang berisi C18 dan nitril. SCX adalah.
Campuran air atau larutan penyangga dalam air dan pelarut organik digunakan untuk mengelusi analit dair kolom
fasa terbalik. Pelarut harus dapat campur dengan air, dan pelarut organik yang umum digunakan adalah asetonitril, metanol, dan tetrahidrofuran (THF). Pelarut lain yang dapat digunakan antara lain etanol atau 2-propanol (isopropil alkohol). Elusi dilakukan secara isokratik (komposisi air-pelarut tidak beruah selama proses pemisahan) atau menggunakan larutan gradien (komposisi air-pelarut berubah selama proses pemisahan, biasanya dengan menurunkan polaritas). pH
fasa gerak memiliki peran penting dalam retensi analit dan selektivitasnya dapat diubah untuk analit-analit tertentu.
Analit bermuatan dapat dipisahkan dalam kolom
fasa terbalik dengan menggunakan pasangan ion (disebut juga interaksi ion). Teknik ini dikenal sebagai
Kromatografi pasangan ion
fasa terbalik.
Lihat juga
Kromatografi fasa-normal
Referensi
Pranala luar
Tables ringkasan berbagai jenis
fasa terbalik, dan informasi tentang fungsionalisasi proses
Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography Principles and Methods Handbook Diarsipkan 2008-12-05 di Wayback Machine.
